新一代测序技术在遗传病研究中的应用

遗传病，是指遗传物质发生改变或者由致病基因所控制的疾病，通常具有垂直传递和终身性的特征。因此，遗传病具有由亲代向后代传递的特点。这种传递不仅是指疾病的传递，最根本的是指致病基因的传递。所以，遗传病的发病表现出一定的家族性。父母的生殖细胞（精子和卵细胞）里携带的致病基因，通过生殖传给子女并引起发病，而且这些子女结婚后还可能把致病基因传给下一代。

根据所涉及遗传物质的改变程序，遗传病的种类可分为四类：

一、单基因病

目前已经发现余种单基因病，主要是指一对等位基因的突变导致的疾病，分别由显性基因和隐性基因突变所致。所谓显性基因是指等位基因（一对同源染色体同位置上控制相对性状的基因）中只要其中之一发生了突变即可导致疾病的基因。隐性基因是指只有当一对等位基因同时发生了突变才能致病的基因。单基因病包括如下几类：常染色体显性遗传病，常染色体隐性遗传病，X染色体显性遗传病，X染色体隐性遗传病，Y染色体遗传病。

二、多基因病

顾名思义，这类疾病涉及多个基因起作用，与单基因病不同的是这些基因没有显性和隐性的关系，每个基因只有微效累加的作用，因此同样的病不同的人由于可能涉及的致病基因数目上的不同，其病情严重程度、复发风险均可有明显的不同，且表现出家族聚集现象，如唇裂就有轻有重，有些人同时还伴有腭裂。值得注意的是多基因病除与遗传有关外，环境因素影响也相当大，故又称多因子病。很多常见病如哮喘、唇裂、精神分裂症、无脑儿、高血压、先天性心血管疾病、癫痫等均为多基因病。

三、染色体病

染色体病或染色体综合征，遗传物质的改变在染色体水平上可见，表现为数目或结构上的改变。由于染色体病累及的基因数目较多，故症状通常很严重，累及多器官、多系统的畸变和功能改变。染色体数目异常疾病：如“21三体”综合征，又称为先天愚型、唐氏综合征，是由于21号染色体数目多了一条而形成的；性腺发育不良，又称为特纳氏综合征，是女性X染色体少一条导致的，形成原因是减数分裂异常形成了不含性染色体的雌雄配子与一个含X染色体的正常的异型配子结合形成的受精卵发育而成；克氏综合征：男性XXY，形成此种个体的受精卵可能是由一个含XX染色体的雌配子与一个含Y染色体的雄配子而成，也可能是由一个正常的雌配子与另一个含XY染色体的雄配子结合而成。染色体结构异常疾病：如猫叫综合征就是由于5号染色体部分缺失而形成的。

四、细胞质遗传病

细胞质遗传物质只存在于线粒体中，因而细胞质遗传病就是线粒体基因病，常见病例有神经肌肉衰弱。由于受精卵中的细胞质主要来源于卵细胞，因而细胞质遗传病取决于母本，表现为“母病子女全病”的特点。

遗传病种类繁多，已经称为严重影响我国人民健康的主要病因，有调查表明每个新生儿中即有3～10个患有各种程度不同的遗传病。遗传病具有先天性、家族性、终身性、遗传性的特点，现代医学还不能改变已出生的人的基因，所以只要致病基因还在，就无法彻底治愈。但是某些病可以通过不停地用药来缓解病情，有些疾病可以通过外科手术来修复病变的器官，有些疾病通过饮食治疗来缓解病情，而所有的这一切治疗手段都是基于快速准确的诊断的基础之上，遗传病临床的及时准确的诊断就显的特别关键。

目前常用的遗传病诊断分四个层次：

一、临床水平层次

临床水平层次是以临床表现特征作为诊断依据，主要表现为两个方面：

1、症状、体征分析症状和(或)体征的出现是患者就诊的主要原因，也是诊断遗传病的重要线索。例如精神发育不全、白内障和肝硬化常提示半乳糖血症的可能性；伸舌、高颧、眼距宽、鼻梁塌陷等特殊的痴呆面容常提示Down综合征。但也有许多症状和体征为多种遗传病所共有，此时若仅以症状与体征为线索诊断遗传病就会很困难，故必须借助于其他手段。

2、系谱(pedigree)或称家系图谱分析：临床上判断单基因病的遗传方式常用系谱分析法，是指对某遗传病患者家族各成员的发病情况进行调查，绘制出该种遗传病的家系图谱，然后再根据绘制的系谱图进行分析，以确定该家系是否患有遗传病及其可能的遗传方式。

各种单基因遗传病常表现出特定的孟德尔式遗传规律。通常，调查其亲属患病情况，将调查材料绘制成系谱进行系谱分析，常有助于单基因病的诊断。要进行正确的系谱分析，首先必须有一个准确可靠的系谱。

二、细胞水平

细胞水平的遗传病诊断主要有组织、细胞学检查和染色体分析。

如遗传性球形红细胞增多症，是一种显性遗传病。通过对患者的细胞学检查，可以发现红细胞变小，中心色度变深，红细胞自溶可高达15%~45%。染色体异常的遗传病一般都可以通过对细胞中的染色体分析，作出明确的诊断。

染色体检查也称核型分析是确诊染色体病的主要方法。由于显带技术的广泛开展，已使染色体病的诊断和定位更加准确。各医疗单位对进行核型分析的适应证有不同的规定，随着技术改进和新的染色体病的发现，需要进行染色体检查的适应证将日益增多。性染色体（包括X染色体和Y染色体）的检查对性染色体数量畸变所致疾病的诊断有一定意义。

三、蛋白质水平（也称成分的生化分析）

蛋白质水平主要通过两个方面来诊断遗传病：

（一）检测基因产物——蛋白质、酶的量和活性；

（二）是检测酶促反应底物或产物的变化；

例如以蛋白质分子的结构和功能缺陷为病变基础的单基因病，往往可以对蛋白质分子本身和酶促反应过程中的底物或产物进行定量或定性分析。由于单基因病的种类繁多，加上蛋白质分子或酶促反应的底物或产物的性质各不相同，所以检测方法也不一致。要在某个医疗部门或研究机构同时建立一套完整的单基因病生化检测系统几乎是不可能的。一些国家为此建立了生化检测的协作网络，不同的部门分别从事不同的单基因病生化测定与研究，同时促进部门间的相互协作。用于生化检测的材料主要有血液、活检组织、尿、粪、阴道分泌物、脱落细胞和培养细胞等。不同遗传病的生化检测可用不同的检测材料。

四、基因水平也就是基因诊断

基因水平的遗传病诊断也就是基因诊断（genediagnosis，又称为DNA诊断），是20世纪70年代在重组DNA技术基础上迅速发展起来的一项应用技术，旨在对患者或收检者的某一特定基因或其转录产物进行分析和检测，从而对相应的遗传病进行诊断。

越来越多的证据表明，遗传病的发生不仅与基因（DNA）的结构有关，而且与转录水平或翻译水平上的变化有关。人体基因组的类型早在受精卵开始时就已形成，因此在人体发育的任何时期，只要获得受检者的基因组DNA，应用恰当的DNA分析技术，便能鉴定出缺陷的基因，而不论该基因产物是否已经表达。而且，应用这一方法，不仅能够检测单个碱基置换、缺失和插入等，还能发现DNA的多态现象以及遗传病的异质性。

新一代测序技术在遗传病研究中的应用

通过临床疾病症状和家系图谱分析的方法进行遗传病的诊断往往作为一个初步的诊断方法，还需要配合其他诊断方案来确诊。对于代谢类疾病往往通过检测代谢产物来进行疾病的诊断，但是诊断往往比较滞后，而且很多遗传疾病很难确认检测的靶标。而染色体遗传病目前采用核型分析诊断较多，核型分析可以检测染色体的拷贝数变异，以及大片段的染色体扩增和缺失，而对于染色体的微扩增和微缺失核型分析则无能为力。而通过基因检测来进行遗传病的检测目前主要采用的技术是毛细管测序，毛细管测序的成本高，而且通量有限，只能检测疾病基因已知的有限的变异位点，对于新的变异以及未知疾病基因的新的遗传疾病的检测就无能为力。

而随着二代测序技术的成熟以及其成本的降低，二代测序技术也逐步应用于遗传病的基因诊断，相对于毛细管测序，采用二代测序检测可以通过全基因组测序和外显子测序来对未知的遗传疾病进行研究和分析，而通过对靶向基因的检测可以对单基因疾病进行基因诊断，而高通量的二代测序一次可以检测多个疾病基因的全序列，同时也可以对家系内的多个先症患者和相关人员同时检测，诊断的结果更准确可靠。对于病因不明的遗传病的研究和诊断目前主要采用全基因组测序和外显子测序，然而目前全基因组测序和外显子测序成本还是比较高，而且获得大量的数据在数据分析上难度较大，所以全基因组测序和外显子测序一般只应用于科研领域，而不适合进行临床样本的检测。

全基因组测序用于新生儿重症监护室患儿的全基因组快速检测

年10月，美国堪萨斯城Children’sMercyHospital的StephenKingsmore教授领导的研究组在SciTranslMed杂志上发表文章RapidWhole-GenomeSequencingforGeneticDiseaseDiagnosisinNeonatalIntensiveCareUnits，阐述了使用illumina的HiSeq对新生儿重症监护室的新生儿的全基因组进行快速检测，确定新生儿的疾病类型，以指导后续的临床诊断和治疗。作者开发了一种STAT-Seq的技术，从获得患儿DNA样本后，只需50个小时既可完成测序、数据分析和报告的输出。保证了对患儿的及时诊断和治疗。

外显子测序用于儿童未知遗传病检测

外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。年以来，外显子组测序技术渐渐为研究者所熟知，越来越多的科学家将其运用到自己的研究之中。外显子组测序是快速定位单基因病致病基因的有力工具，年8月，Nature发表了12个人类外显子组测序的研究论文，通过对4位弗里曼谢尔登综合征患者进行外显子组测序及过滤分析，研究人员准确的找出了患者DNA中致病的MYH3基因突变，证明了使用外显子组测序方法确定罕见致病变异基因的可行性和应用价值。年11月，NatGenet在线发表了一篇首次成功运用外显子组测序技术发现一种未知病因的罕见遗传疾病米勒综合征致病基因的报导。至此以后，外显子组测序在单基因病的研究领域中硕果累累，相关文章数量每年呈指数增长。最近，应用外显子组测序发现了家族hypobetalipoproteinemia疾病的一个新的致病突变。对于单基因病研究，这种高通量的外显子组测序技术相比之前基于连锁分析定位克隆的传统方法优势大大增加，不再像传统方法那样依赖于完整的家系，可将来自于不同家系的样本一起研究，并且耗时明显缩短，几周内即可完成实验和信息分析，得到的候选基因数目也显著减少且定位准确，便于后期筛选验证。

二代测序对单基因遗传病诊断

而对单基因疾病的检测，传统的方法是采用家系分析，性状分析，生化分析以及基因诊断的方法。家系分析往往作为单基因病诊断的一个辅助手段。而性状分析和生化分析只是在疾病发生后才进行诊断，往往已经错过了最佳的治疗期。由于单基因疾病是有基因变异导致，基因诊断是最简单也是最直接的诊断手段，以前传统的基因诊断采用MLPA，Southern杂交，AFLP和STR等技术，这些技术操作复杂，检测结果判定也比较困难。随着测序技术的完善，测序成为单基因几百检测的首选手段，而传统的毛细管测序其通量有限，只能检测基因的一小个片段。而近两年随着二代测序技术的成熟，分析软件的完善以及成本的降低，二代测序成为单基因疾病基因诊断的一个最有效的技术。

线粒体疾病基因检测

人类mtDNA的长度为16,bp，拥有有37个基因，编码了两种rRNA（12SrRNA和16SrRNA）、22种tRNA（同样转运20种标准氨基酸，只是亮氨酸和丝氨酸都有两种对应的tRNA）以及13种多肽（呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的亚基）。线粒体病是遗传缺损引起线粒体代谢酶缺陷，使ATP合成障碍、能量来源不足导致的一组异质性病变。线粒体疾病早在年既被报道，这类疾病可有多种遗传模式，如母系遗传、孟德尔遗传，或者两者均有。除少数线粒体病仅影响单一器官外，绝大多数可影响多器官系统。线粒体呼吸链是有氧代谢必需的和最终的通路，因而往往那些依赖于有氧代谢的组织和器官如心、脑和肌肉最先受累，而且症状突出。目前与线粒体基因变异相关的疾病报道有数十种，表现为多种不同表型，其常见的临床表现包括眼睑下垂、外眼肌麻痹、近端肌病、运动不耐受、心肌病、感觉神经性耳聋、视神经萎缩、色素性视网膜病、糖尿病、痉挛或惊厥、痴呆、偏头痛、类卒中样发作、舞蹈症和痴呆等。目前常见的线粒体疾病包括如下几类：Kearns-Sayre综合征（KSS），Leigh综合征，线粒体DNA缺失综合征（mitochondrialDNAdepletionsyndrome，MDS），线粒体脑肌病、乳酸中毒以及卒中样发作（mitochondrialencephalomyopathy,lacticacidosisandstrokelikeepisodes，MELAS），肌阵挛性癫痫发作伴破碎红纤维（myoclonusepilepsywithraggedredfibers，MERRF），线粒体神经消化道脑肌病（mitochondrialneurogastrointestinalencephalomyopathy，MNGIE），神经病、共济失调及色素性视网膜炎（neuropathy,ataxiaandretinitispigmentosa，NARP），Pearson综合征以及进行性眼外肌麻痹（progressiveexternalophthalmoplegia，PEO）。

而对线粒体疾病常用的诊断方法包括：血生化检查，肌肉冰冻切片Gomori染色活检，CT或MRI检查，肌电图检测和线粒体基因组检测。而目前线粒体基因组检测越来越多的被应用到临床，如：CPEO和KSS为mtDNA片断缺失，可能发生在卵子或胚胎形成期；80%的MELAS病人为mtDNAtRNA基因点突变；MERRF综合征是tRNA基因位点点突变。由于线粒体的基因较大，而且每个细胞具有多个线粒体，而且线粒体具有异质性，使用毛细管测序对于线粒体疾病基因变异的检测就很困难，而二代测序非常适合这类变异的检测，深度测序还可以发现那些变异水平很低的突变。而且有些线粒体疾病不仅仅涉及到mtDNA，还与线粒体内的蛋白结构功能相关，而这些蛋白大部分是由基因组DNA编码，采用二代测序可以同时检测mtDNA和编码线粒体蛋白的基因组DNA。

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